工艺放大过程中CO问题的机制探索和解决

作者简介

刘旭平

上海倍谙基生物科技副总经理

年3月获华东理工大学生物化工专业工学博士学位，并加入华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室至今，指导在读硕士、博士研究生30余名。主持承担十几项国家计划、重大科技专项和国家自然科学基金以及教育部、上海市和企业横向课题等。主要研究方向为无血清无蛋白培养基的设计与开发、高密度细胞培养和细胞扩增过程物质能量代谢调控、生物反应器放大和过程优化等关键科学与工程问题的研究入手，建立细胞大规模培养技术平台和抗体疫苗等药物高效工业化生产关键技术。在国际和国内期刊上发表20多篇科学论文，获授权专利10余项，多次参加国际和国内学术会议并做口头报告。参与完成了十多个生物药IND并获得临床批件。

概要

刘旭平老师从过去20年美国FDA批准的治疗型药物的趋势及抗体类药物的占比，预测国内抗体类药物的也将会呈现井喷式的发展。并且，根据目前国内生物药现状分析，接下来国内抗体药物会真正进入生产环节效能的竞争，对生产工艺产量和质量提出更高的要求。在工艺开发阶段，运用QbD的理念就对生产过程参数对于后续细胞生长、代谢以及产物表达之间的影响进行非常系统的研究。

背景介绍

1.治疗性药物的发展概括

2.中国抗体类药物的现状和趋势

1）申报扎堆严重，热门靶点超过15家；仿制药居多，创新性不足；抢速度，重申报，抗体化工程。

2）生产工艺的稳定高效，产量和质量；ADC、双特异性抗体等创新性。

3.QbD理念

QbI：质量源于检验检验只是一种事后的行为，检验时只能抽取一定量的药品。

QbP：质量源于生产若药品研发初始阶段，生产工艺未经充分优化、筛选、验证，则即使严格按照工艺生产，仍无法保证产品的质量。

QbD：质量源于设计将药品的质量控制点进一步前移至药品的设计与开发、阶段，消除因药品及其生产工艺设计不合理而可能对产品质量带来的不利影响。

深入了解过程参数与细胞生长、代谢和产物表达之间的关系及其内在主要代谢调节机制，对指导哺乳动物细胞培养过程优化、放大、强化具有十分重要的科学意义和实际应用价值。系统生物学和生物信息学方法，通过多组学，跨平台分析能够更合理、系统地探究过程参数对细胞的作用机制。

4.系统生物学和生物信息学

系统生物学(SystemsBiology)

系统地研究一个生物系统中所有组成成分（基因，mRNA，蛋白质等）的构成以及在特定条件下这些组分间的相互关系，并分析生物系统在一定时间内的动力学过程。

系统生物学从系统水平来理解生物学系统，利用一系列的原理和方法学来研究分子行为与系统特性功能的关系，通过多种组学的联合以及计算生物学来定量阐明和预测生物的功能、表型和行为。

生物信息学（Bioinformatics）

狭义的生物信息学是指计算机科学和数学应用与生物大分子信息的获取、加工、存储、分析、检索与分析，以达到理解这些生物大分子信息的生物学意义的一门交叉学科。

广义的生物信息学是指运用计算机技术，处理、分析生物学数据，以揭示生物学数据背后蕴藏有意义的所有知识体系。

组学（Omics）

1.基因组学（Genomics）

基因组（Genome）：

生物体配子中所包含的全部染色体及其基因，包括细胞质基因组，为物种全部遗传信息的总和，也指某一生物的所有DNA。

基因组学（Genomics）：

年提出，指对生物体所有基因组作图，核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门学科，是在全基因组范围研究基因结构、组成、功能及其进化。

基因组学研究内容主要包括：

基因组DNA的序列组成、染色体分子水平的结构特征、全基因组的基因数目、功能和分类、基因组水平的基因表达和调控、不同物种之间基因组的进化关系。

基因组学研究的最终目标：

获得生物体全部基因组序列、鉴定所有基因的功能、明确基因之间的功能关系、阐明基因组的运行机制。

2.转录组学（Transcriptome）

1）DNA---mRNA/smallRNA/IncRNA---Protein---Metabolites(Transcriptome)：转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和。

转录组学是在RNA整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律。

转录组学方法主要包括基因芯片（Microarray）和RNA-seq两种。

2）标准转录组测序（mRNA）：可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下几乎所有的mRNA转录本。

基因转录水平研究，如基因表达量、不同样本间基因的差异表达等；转录本结构变异研究，如可变剪接、基因融合；开发SNP（singlenucleotidepolymorphism）和SSR（simplesequencerepeates）

非编码区转录组测序：非编码区RNA（IncRNA）测序：能区分转录本来自正义链还是反义链表达的信息，可帮助分析等位基因的特定表达和基因功能的分析。

小RNA测序：小RNA测序功能分析通常在转录和转录后阶段调控基因

3.蛋白质组学（Proteomics）

蛋白质组（proteome）是澳大利亚学者Williams和Wikins于年首先提出，指一个细胞、一种组织或一种生物体的基因组所表达的全部蛋白。

蛋白质组学研究的本质是在大规模的水平上对蛋白质进行高通量、系统性的研究。包括蛋白质的表达水平，翻译后修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，揭示蛋白质功能和细胞生命活动的规律。

4.代谢组学（Metabolomics）

代谢组学：对生物体内所有代谢物进行定性定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。

目前代谢组的大小仍不确定，据预测人类细胞中代谢物可能高达，种。

5.组学的应用（Omicstechnologyapplications）

Biofuelsproduction、Plant-microbeinteractions、Cancerbiology。

不合适的二氧化碳分压在大规模培养过程普遍存在

CHO细胞pCO2正常生理范围在31-54mmHg，在流加培养（＞00L）后期pCO2＞mmHg，灌注培养（-L）过程中pCO2＞mmHg，CO2分压过高情况尤为常见。CO2高分压是怎么产生的？

1.二氧化碳的来源

1）生物来源：细胞通过呼吸作用产生

2）非生物来源：为维持培养PH所添加的碳酸氢盐、碳酸盐和CO2等。

2.理解二氧化碳对细胞培养过程的影响

影响PHi、ROS（Reactiveoxygenspecies）：

1）对放大过程的影响：pH缓冲液、鼓泡环、搅拌、酸/碱的添加……

2）对过程的影响：细胞生长、细胞代谢、产物质量、产量。如YGL上升、产量下降、细胞生长抑制、唾液酸含量下降、半乳糖苷化提高、等电点下降。

3.二氧化碳控制策略研究进展

宏观控制策略：缓冲体系的合理使用及降低NaHCO3的用量；优化反应器设计及合理参数操作。

微观控制策略：细胞株的驯化以适应极端pCO2的响应。

CO2控制存在的问题：缺乏对培养过程中pCO2问题的深入认识，哺乳动物细胞培养过程管理与控制，尤其是pCO2的合理控制仍是现阶段蛋白类药物工业化生产所面临的难题之一。

4.高二氧化碳分压对过程的影响

NormalpCO2（30-50mmHg）；HighpCO2（-mmHg）：

1）高二氧化碳分压影响：

细胞生长受到影响：峰值降低、细胞活率降低；

乳酸代谢消耗受到抑制，导致乳酸偏高；

细胞抗体合成受到影响，后期蛋白表达量明显降低。

2）线粒体膜电势、ATP含量、比氧气消耗速率、线粒体蛋白的功能紊乱。

3）代谢流分析：糖酵解通道稳定，但是丙酮酸进入TCA循环通道下降。

代谢组分析（Metabolome）:TCA循环碳氮需求量下降，柠檬酸溢出通道被激活，AKG含量过低，合成存在不足。

转录组分析（Transcriptome）:LDHC降低，乳酸不消耗；IDH2升高AKG消耗增多；DIC升高，柠檬酸溢出通道被激活。

酶活力检测（Enzymeactivity）：IDH3酶活力显著降低。

解决策略：添加α-酮戊二酸。

添加α-酮戊二酸后，乳酸消耗得到一定程度的恢复，线粒体功能的恢复，IVCC得到提高。

通过α-酮戊二酸的添加，高二氧化碳分压带来的不利影响得到缓解，抗体的产量恢复到原有水平。

因此，高CO2分压下，细胞代谢受到影响：改变了乳酸代谢状态，线粒体的功能紊乱，IDH3转录水平下降，且酶活力在高CO2分压下下降，α-酮戊二酸的添加缓解了以上不利影响。

5.低二氧化碳分压对过程的影响

NormalpCO2（30-50mmHg）；LowpCO2（10-20mmHg）：

细胞后期维持能力下降，乳酸消耗受到抑制，细胞抗体产量受到抑制。

1)胞内PH在24小时内快速上升：通过下调胞内pH，乳酸的生成得到抑制。

2）代谢流分析：两个条件下，葡萄糖到丙酮酸流量相当，低CO2条件下TCA循环流量明显下降。

3）非靶向代谢组分析：TCA循环中间代谢物含量总体下降；两条件下，丙酮酸浓度无法检测出有限浓度；低CO2条件下，乳酸含量明显上升。

4）低CO2分压对细胞生长代谢的影响：LDHα转录水平上调及酶活性上升。

总体上，低CO2分压对细胞生长代谢的影响包括：改变了乳酸的代谢状态，导致胞内pH上升，LDHα转录水平上调及酶活性上升。

6.理解二氧化碳对细胞培养过程的影响

pH、CO2分压及乳酸的关系：

L：乳酸浓度

pCO2:CO2分压（%/mmHg）

S:CO2溶解系数（mM%）

Bi:培养体系原有的碳酸盐浓度（mM）

BBase:添加的碱浓度（NaOH，mM）

BFed:流加过程中补碱量（mM）

过程控制策略:

1）鼓泡环：在放大体系至1L微孔通气条件下，细胞密度降低，产量降低、产物比生产速率无明显改变。所以在放大过程中要注意CO2分压过高对细胞培养的影响。

2）表层通气过大：细胞维持变差，产量下降。在很多生产工艺过程中，为了保证罐压以及控制泡沫，表层通气设定过大，会发现细胞维持变差以及产量的下降。

总结

通过系统全面地利用组学的方法分析，过高CO2分压和过低CO2分压都会对细胞产生影响，提醒工艺人员在开发工艺过程中，不仅要